4.14 클로스트리디움 퍼프린젠스

4.14.1 정성시험

가. 증균배양

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL를 Cooked Meat 배지(배지 33TM366)의 아랫부분에 접종하여 35～ 37℃에서 18～24시간 동안 혐기배양한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

Clostridium perfringens 한천배지(배지 27TM1886) 또는 TSC 한천배지(배지 41TM1826TM615)에 증균배양액을 접종하여 35∼37℃에서 18～24시간 혐기배양한 결과 Clostridium perfringens 한천배지에서 직경 2mm 정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 불투명한 백색환이 있는 집락 또는 TSC 한천배지에서 불투명한 환을 가지는 황회색 집락은 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지(배지 8TM341) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40TMH103)에 옮겨 35∼37℃에서 18～24시간 혐기배양한 후 그람염색을 실시한다. 또 동시에 보통한천배지 또는 Tryptic Soy 한천배지를 35∼37℃에서 18～24시간 호기 배양하여 균의 비발육을 확인한다. 그람양성간균으로 확인된 집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose를 1% 가한 4종의 GAM 배지(배지 34)에 옮겨 35∼37℃에서 3일간 배양 후 BTB-MR지시약(시액 4)을 가해서 붉은 색으로 변하는 것을 양성으로 판정한다. 운동성은 GAM 배지(배지 34)에서 35∼37℃에서 1～2일간 배양하여 운동성의 유무를 관찰한다. Glucose, lactose, inositol과 raffinose를 분해 하며 운동성이 없는 것을 확인하면 Lecithinase 시험을 실시한다. TSC한천배지(배지 41TM1826TM615)에 접종하여 35∼37℃에서 24시간 혐기배양한 후 2～4 mm의 불투명한 환을 가지는 황회색 집락을 양성으로 판정한다.

4.14.2 정량시험

가. 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가한 후 1∼2분간 저속으로 균질화 한 후 10배 단계 희석액을 만든다. 시험용액 및 단계별 희석액 1 mL씩을 2매 이상의 멸균 페트리 접시에 무균적으로 분주하고, 43～45℃로 유지한 TSC 한천배지(배지 41TM1826TM615) 10∼15 mL를 가하여 좌우로 돌리면서 잘 혼합한 후 응고시킨다. 응고된 배지 위에 다시 동일한 배지 10TM417 mL를 가하여 중첩시킨 후 35∼37℃에서 24±2 시간 혐기 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액 1mL을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 150개 이하의 전형적인 검은색 집락이 확인된 평판을 선별하여 각 집락수를 계수한다.

나. 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8TM341) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40TMH103)에 접종하고 35∼37℃ 에서 18∼24 시간 혐기배양한 후 4.14.1 정성시험

다. 확인시험에 따라 실시한다.

다. 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예로 10-4에서 평균집락수가 85개이었고, 이 중 5개의 집락을 확인한 결과 4개의 집락이 클로스트리디움 퍼프린젠스로 동정되었을 경우 85 × (4/5) × 10,000 = 680,000으로 계산한다.