2) 총 호기성 생균수 시험법

총 호기성 생균수 시험법은 화장품 중 총 호기성 생균(세균 및 진균)수를 측정 하는 시험방법이다.

가) 검액의 조제

1)항에 따라 검액을 조제한다.

나) 배지

총 호기성 세균수시험은 변형레틴한천배지TM157 또는 대두카제인소화한천배지TMH103를 사용하고 진균수시험은 항생물질 첨가 포테이토 덱스트로즈 한천배지TM1924TMH105 또는 항생물질 첨가 사브로포도당한천배지TM622TMH104를 사용한다. 위의 배지 이외에 배지성능 및 시험법 적합성 시험을 통하여 검증된 다른 미생물 검출용 배지도 사용할 수 있고, 세균의 혼입이 없다고 예상된 때나 세균의 혼입이 있어도 눈으로 판 별이 가능하면 항생물질을 첨가하지 않을 수 있다.

변형레틴액체배지TM159TM2158 (Modified letheen broth)

육제펩톤

20.0 g

카제인의 판크레아틴 소화물

5.0 g

효모엑스

2.0 g

육엑스

5.0 g

염화나트륨

5.0 g

폴리소르베이트 80

5.0 g

레시틴

0.7 g

아황산수소나트륨

0.1 g

정제수

1000 mL

이상을 달아 정제수에 녹여 1 L로 하고 멸균후의 pH가 7.2 ± 0.2가 되도록 조정하고 121 ℃에서 15분간 고압멸균 한다.

변형레틴한천배지TM157(Modified letheen agar)

프로테오즈 펩톤

10.0 g

카제인의 판크레아틱소화물

10.0 g

효모엑스

2.0 g

육엑스

3.0 g

염화나트륨

5.0 g

포도당

1.0 g

폴리소르베이트 80

7.0 g

레시틴

1.0 g

아황산수소나트륨

0.1 g

한천

20.0 g

정제수

1000 mL

이상을 달아 정제수에 녹여 1 L로 하고 멸균후의 pH가 7.2 ± 0.2가 되도록 조정하고 121 ℃에서 15분간 고압멸균 한다.

대두카제인소화한천배지TMH103(Tryptic soy agar)

카제인제 펩톤

15.0 g

대두제 펩톤

5.0 g

염화나트륨

5.0 g

한천

15.0 g

정제수

1000 mL

이상을 달아 정제수에 녹여 1 L로 하고 멸균후의 pH가 7.2 ± 0.1이 되도록 조정하고 121 ℃에서 15분간 고압멸균 한다.

항생물질첨가 포테이토덱스트로즈한천배지TM1924TMH105(Potato dextrose agar)

감자침출물

200.0 g

포도당

20.0 g

한천

15.0 g

정제수

1000 mL

이상을 달아 정제수에 녹여 1 L로 하고 121 ℃에서 15분간 고압멸균 한다. 사용 하기 전에 1 L당 40 mg의 염산테트라사이클린을 멸균배지에 첨가하고 10 % 주 석산용액을 넣어 pH를 5.6 ± 0.2 로 조정하거나, 세균 혼입의 문제가 있는 경우 3.5 ± 0.1로 조정할 수 있다. 200.0 g의 감자침출물 대신 4.0 g의 감자추출물이 사 용될 수 있다.

항생물질첨가사부로포도당한천배지TM622TMH104(Sabouraud dextrose agar)

육제 또는 카제인제 펩톤

10.0 g

포도당

40.0 g

한천

15.0 g

정제수

1000 mL

이상을 달아 정제수에 녹여 1 L로 하고 121 ℃에서 15분간 고압멸균한 다음의 pH가 5.6 ± 0.2이 되도록 조정한다. 쓸 때 배지 1000 mL당 벤질페니실린칼륨 0.10 g과 테트라사이클린 0.10 g을 멸균용액으로서 넣거나 배지 1000 mL당 클로 람페니콜 50 mg을 넣는다.

다) 조작

(1) 세균수 시험 ㉮ 한천평판도말법 직경 9 ∼ 10 cm 페트리 접시내에 미리 굳힌 세균시험용 배지 표면에 전처리 검액 0.1 mL이상 도말한다.

㉯ 한천평판희석법 검액 1 mL를 같은 크기의 페트리접시에 넣고 그 위 에 멸균 후 45 ℃로 식힌 15 mL의 세균시험용 배지를 넣어 잘 혼합한다. 검체당 최소 2개의 평판을 준비하고 30∼35 ℃에서 적어도 48시간 배양하 는데 이때 최대 균집락수를 갖는 평판을 사용하되 평판당 300개 이하의 균집락을 최대치로 하여 총 세균수를 측정한다.

(2) 진균수 시험 : ‘(1) 세균수 시험’에 따라 시험을 실시하되 배지는 진균수시 험용 배지를 사용하여 배양온도 20∼25 ℃에서 적어도 5일간 배양한 후 100 개 이하의 균집락이 나타나는 평판을 세어 총 진균수를 측정한다.

라) 배지성능 및 시험법 적합성시험

시판배지는 배치마다 시험하며, 조제한 배지는 조제한 배치마다 시험한다. 검체의 유ㆍ무하에서 총 호기성 생균수시험법에 따라 제조된 검액ㆍ대조액에 표 1.에 기재된 시험균주를 각각 100cfu 이하가 되도록 접종하여 규정된 총호 기성생균수시험법에 따라 배양할 때 검액에서 회수한 균수가 대조액에서 회수한 균수의 1/2 이상이어야 한다. 검체 중 보존제 등의 항균활성으로 인해 증식이 저해되는 경우(검액에서 회수한 균수가 대조액에서 회수한 균수의 1/2 미만인 경우)에는 결과의 유효성을 확보하기 위하여 총 호기성 생균수 시험법을 변경해야 한다. 항균활성을 중화하기 위하여 희석 및 중화제(표2.)를 사용할 수 있다. 또한, 시험에 사용된 배지 및 희석액 또는 시험 조작상의 무균 상태를 확인하기 위하여 완충식염펩톤수(pH 7.0)를 대조로 하여 총호기성 생 균수시험을 실시할 때 미생물의 성장이 나타나서는 안 된다.

표 1. 총호기성생균수 배지성능시험용 균주 및 배양조건

표2. 항균활성에 대한 중화제

시험균주

배양 Escherichia coli

ATCC

8739,

NCIMB

8545,

CIP53.126,

NBRC 3972 또는 KCTC 2571

호기배양 30 ∼ 35 ℃ 48시간 Bacillus subtilis

ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62,

NBRC 3134 또는 KCTC 1021

Staphylococcus aureus

ATCC

6538,

NCIMB

9518,

CIP

4.83,

NRRC 13276 또는 KCTC 3881

Candida albicans

ATCC

10231,

NCPF

3179,

IP48.72,

NBRC1594 또는 KCTC 7965

호기배양 20 ∼ 25 ℃ 5일

화장품 중 미생물 발육저지물질

항균성을 중화시킬 수 있는 중화제 페놀 화합물：

파라벤, 페녹시에탄올,페닐에탄올 등

아닐리드

레시틴,

폴리소르베이트 80,

지방알코올의 에틸렌 옥사이드축합물(condensate), 비이온성 계면활성제

4급 암모늄 화합물,

양이온성 계면활성제

레시틴, 사포닌,

폴리소르베이트 80,

도데실 황산나트륨,

지방 알코올의에틸렌 옥사이드 축합물 알데하이드,

포름알데히드－유리 제제

글리신, 히스티딘