18-Ⅱ 특정미생물시험

1. 서론

이 시험은 규정된 조건에서 검출할 수 있는 특정미생물 이 존재하지 않거나 그 존재가 한정적인지를 판정하는 방법이다. 이 시험은 원료나 제제가 이미 정해진 미생물 학적품질규격에 적합한지의 여부를 판정하는 것을 주목 적으로 한다. 채취검체수를 포함하여 지시된 방법에 따라 시험하여 결과를 판정한다. 이 장에서 규정한 시험법과의 동등성이 인정되는 경우에는 자동화법을 포함한 다른 미 생물학적 방법을 적용할 수 있다.

2. 기본조작

검체의 조제는 ｢생균수시험｣에 따른다. 검체가 항균활성 을 가지고 있을 때는 ｢생균수시험｣에 따라 중화한다. 검 체의 조제에 계면활성제를 쓸 때는 ｢생균수시험｣에서와 같이 미생물에 대한 독성이 없고 사용하는 불활성화제와 상호작용이 없는 것을 확인한다.

3. 배지의 성능, 시험법의 적합성 및 음성대조

제품 존재 하에 시험법의 미생물 검출 능력을 확인한다. 그리고 시험법의 결과에 영향을 줄 수 있는 시험법이나 제품의 변경이 있을 때는 적합성을 확인한다.

3.1. 시험균의 조제

시험균은 표준화된 안정한 현탁액을 쓰거나 다음과 같 은 방법으로 조제한다. 시험에 쓰는 미생물은 최초의 마스터시드로트(master seed-lot)로부터의 계대수가 5 회를 초과하지 않게 시드로트 배양관리방법 (seed-lot system)으로 관리한다.

3.1.1. 호기성미생물 각 세균시험용 균주를 대두카제 인소화액체배지TMH102TMKH003 또는 대두카제인소화한천배지TMH103에서 각 각 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 별도로 칸디다알비칸스용의 시험균주는 사부로포도당한천배지TMH104 또는 사부로포도당액체배지TMH106에서 각각 20 ~ 25 ℃에서

2 ~ 3 일간 배양한다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus) : 예를 들면 ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC

13276 또는 KCTC 1927

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) : 예를 들면 ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC

13275 또는 KCTC 2513

대장균(Escherichia coli) : 예를 들면 ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, NBRC 3972 또는 KCTC 2571

살모넬라(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium) : 예를 들면 ATCC 14028 또는 이와 동등한 것 또는 살모넬라(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony) : 예를 들 면 NBRC 100797, NCTC 6017 또는 CIP 80.39

칸디다알비칸스(Candida albicans) : 예를 들면 ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 또는 NBRC 1594, KCTC 7965

시험균 현탁액의 조제는 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충 액TMH101TMTH001 또는 pH 7.2 인산완충액TMT007TMTH006을 쓴다. 현탁액은 2 시간 이내에 쓰며, 2 ~ 8 ℃에서 보존하는 경우에는 24 시 간 이내에 쓴다.

3.1.2. 클로스트리디아 예를 들면 ATCC 11437(NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP

100651) 또는 ATCC 19404(NCTC 532 또는 CIP 79.3)와 같은 클로스트리디아(Clostridium sporogenes)를 쓴다. 클로스트리디아 시험균주를 강 화 클로스트리디아배지TMH115 중에 접종하고 30 ~ 35 ℃에 서 24 ~ 48 시간 혐기적 조건에서 배양한다. C. sporogenes의 영양형 세포의 신선한 현탁액을 조제하 여 희석하는 대신에 아포현탁액을 접종균액으로 사용 할 수 있다. 아포현탁액은 보증된 기간 내에서는 2 ~

8 ℃에서 보존할 수 있다.

3.2. 음성대조

시험조건을 확인하기 위해 검액 대신 사용한 희석액을 써서 음성대조시험을 한다. 미생물이 증식해서는 안 된 다. 음성대조는 4.에 따른 제품을 시험할 때도 측정한 다. 시험에 실패한 음성대조는 고찰한다.

표 Ⅱ-1 배지의 증식촉진, 증식억제 및 감별특성 배지 특성 시험균주 담즙산저항성그람음성균시험 증식촉진 E. coli, P. aeruginosa

가) 증식억제 S. aureus 바이올렛·레드· 담즙산·포도당한 천배지TMH117TMH108 모젤장내세균증균 액체배지TMH107 증식촉진 및 감별 E. coli, P. aeruginosa 대장균시험 맥콘키액체배지TMH109 증식촉진 E. coli

나) 증식억제 S. aureus 맥콘키한천배지TMH110 증식촉진 및 감별 E. coli 살모넬라시험 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 또는 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony

다) 증식억제 S. aureus 라파포드바시리아 디스살모넬라증균 액체배지TMH111 증식촉진 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 또는 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony 녹농균시험 세트리미드한천배 지TMH113 엑스엘디한천배지TMH112 (XLD agar) 증식촉진 및 감별 증식촉진 P. aeruginosa

라) 증식억제 E. coli 황색포도상구균시험 증식촉진 및 감별 S. aureus 만니톨염화나트륨 한천배지TMH114

마) 증식억제 E. coli 클로스트리디아시험 강화클로스트리디 아배지TMH115 증식촉진 Cl. sporogenes 콜롬비아한천배지TMH116 증식촉진 Cl. sporogenes 칸디다알비칸스시험 사부로포도당액체 배지TMH106 증식촉진 C. albicans 사부로포도당한천 배지TMH104 증식촉진 및 감별 C. albicans

3.3. 배지의 성능시험

시판배지는 배치마다 시험한다. 건조배지 또는 각 성분 을 가지고 조제한 배지는 조제 배치마다 시험한다. 표 II-1의 내용과 같이 관련 배지에 대하여 적절한 특성 을 확인한다.

증식촉진특성시험, 액체배지 적당한 배지의 일부에 적 절한 미생물을 소량(100 CFU 이하) 접종한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에서 규정되어 있는 배양기간 중 최단시간 이내로 한다. 이전 시험을 통해 유효성이 확인된 배치의 배지에서 얻은 증식과 동 등한 증식을 확인한다.

증식촉진특성시험, 고체배지 각 평판배지에 적당한 미 생물을 소량(100 CFU 이하) 접종하고 한천평판도말 법으로 시험한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간 은 시험법에 규정되어 있는 배양기간 중 최단시간 이내 로 한다. 이전 시험을 통해 유효성이 확인된 배치의 배 지에서 얻은 증식과 동등한 증식을 확인한다.

증식억제특성시험, 액체 또는 고체배지 적당한 배지에 적절한 미생물을 적어도 100 CFU 접종한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있 는 배양기간 중 최장시간 이상으로 한다. 시험균의 증 식이 확인되지 않는다.

감별특성시험 각 평판배지에 적당한 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종하고 한천평판도말법으로 시험 한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간의 범위 내로 한다. 집락의 형 상과 감별반응은 이전 시험을 통해 확인된 배치의 배지 에서 얻은 결과와 동등함을 확인한다.

3.4. 시험법의 적합성

검체마다 4.의 관련 항목에 기재되어 있는 대로 검액을 조제한다. 규정된 증균배지에 혼합할 때 각 시험균을 넣는다. 시험균은 개별적으로 접종한다. 접종한 시험액 중 100 CFU 이하에 해당하는 균수의 미생물을 쓴다. 4.의 관련항목에 따라 시험한다. 다만 규정된 배양기간 중 최단시간으로 한다. 특정미생물은 4.에 기재된 감별 반응으로 검출되어야 한다. 제품의 항균활성이 인정되 는 경우에는 시험방법의 변경이 필요하다(｢생균수시험 ｣의 4.5.3. 항균 활성의 중화·제거 항 참조). 어떠한 특정 제품에서 규정된 시험법으로 미생물에 대한 항균 활성을 중화할 수 없는 경우에는 억제된 미생물이 그 검체 중에 존재하지 않는다고 간주해도 된다.

4. 제품의 시험

4.1. 담즙산저항성 그람음성균

4.1.1. 검액 조제 및 전(前)배양 검체 1 g 이상을 달 아 그 10 배 희석액을 ｢생균수시험｣에 따라 조제하며, 이때 희석액으로는 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003를 써서 섞 은 다음 균을 소생시키기에 충분하나 증균을 촉진시키 지 않는 적절한 시간(보통 2 시간이며 5 시간 이내) 동안 20 ~ 25 ℃에서 배양한다.

4.1.2. 부정시험 따로 규정이 없는 한, 4.1.1.에서 조 제한 제품 1 g에 해당하는 검액을 모젤장내세균증균액 체배지TMH107에 접종한다. 30 ~ 35 ℃에서 24 ~ 48 시간 배 양한 다음 바이올렛·레드·담즙산·포도당한천배지TMH117TMH108에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 집 락의 증식이 없으면 그 제품은 이 시험에 적합하다.

4.1.3. 정량시험

4.1.3.1. 선택배양 4.1.1.에 기재되어 있는 조제액 및/ 또는 그 희석액으로 각각 검체의 0.1 g, 0.01 g, 0.001 g (또는 0.1 mL, 001 mL, 0.001 mL) 해당량을 적당량의 모젤장내세균증균액체배지TMH107에 접종한다. 30 ~ 35 ℃에서

24 ~ 48 시간 배양 한 다음 바이올렛·레드·담즙산·포 도당 한천배지TMH117TMH108에 각 배양액을 이식하고 30 ~ 35 ℃에서

18 ~ 24 시간 배양한다.

4.1.3.2. 판정 집락의 증식이 인정된 경우에는 양성으로 판정한다. 양성결과로 나타난 제품의 최소량과 음성 결과 로 나타난 최대량을 기재하고 표 II-2로부터 세균의 추 정값을 구한다.

표 II-2 결과의 판정 제품의 각 양에 대한 결과 제품 1 g 또는

1 mL 당 세균의

0.1 g

0.01 g

0.001 g 또는

0.1 mL 또는

0.01 mL 또는

0.001 mL 추정수 + + +

103 보다 크다 + + -

103 보다 작고

102 보다 크다 + - -

102 보다 작고

10 보다 크다 - - -

10 보다 작다

4.2. 대장균

4.2.1. 검액의 조제 및 전배양 검체 1 g 이상을 취하 여 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3.4.에서 결정한)의 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003에 접종 하고 섞은 다음 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양 한다.

4.2.2. 선택배양 전배양한 배양액 용기를 흔들어 섞은 다음, 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003의 1 mL를 맥콘키액체 배지TMH109 100 mL에 넣는다. 42 ~ 44 ℃에서 24 ~ 48 시 간 배양한 다음 맥콘키한천배지TMH110에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 72 시간 배양한다.

4.2.3. 판정 집락의 증식은 대장균의 존재 가능성을 나타낸다. 이때는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확 인한다. 집락이 없거나 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

4.3. 살모넬라

4.3.1. 검액 조제 및 전배양 「생균수시험」에 따라 검 체를 준비하고, 10 g 또는 10 mL 이상에 해당하는 양 을 취하여 적당량(3.4.에서 결정한)의 대두카제인소 화액체배지TMH102TMKH003에 접종하고 섞은 다음 30 ∼ 35 ℃에서

18 ∼ 24 시간 배양한다.

4.3.2. 선택배양 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003 0.1 mL를 라파포트바시리아디스살모넬라 증균액체배지TMH111 10 mL 에 접종한다. 30 ∼ 35 ℃에서 18 ∼ 24 시간 배양 한 다음 XLD 한천배지TMH112에 이식하고 30 ∼ 35 ℃에서

18 ∼ 48 시간 배양한다.

4.3.3. 판정 충분히 증식한 빨간색집락은 중심부에 흑 점의 유무에 관계없이 살모넬라의 존재 가능성을 나타 낸다. 이때는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한 다. 기재되어 있는 종류의 집락이 없거나 동정시험에 서 음성으로 판정될 때 그 제품은 이 시험에 적합하 다.

4.4. 녹농균

4.4.1. 검액조제 및 전배양 검체 1 g 이상을 취하고 ｢ 생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량(3.4.에 서 결정한)의 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003에 접종하여 섞 는다. 경피흡수제를 시험할 때는 ｢생균수시험｣의 4.5.1.에 기재한 대로 조제하고 패치 1 개에 해당하는 양을 멸균멤브레인필터로 여과하고 이 멤브레인필터를

100 mL의 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003 중에 넣는다. 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다.

4.4.2. 선택배양 세트리미드한천배지TMH113에 이식하고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 72 시간 배양한다.

4.4.3. 판정 집락의 증식은 녹농균의 존재 가능성을 나타낸다. 이때는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확 인한다. 집락이 없거나 동정시험에서 음성으로 판정될 때 그 제품은 이 시험에 적합하다.

4.5. 황색포도상구균

4.5.1. 검액조제 및 전배양 검체 1 g 이상을 취하여 ｢ 생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액의 10 mL 혹 은 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량(3.4.에서 결정한)의 대두카제인소화액체배지TMH102TMKH003에 접종하여 섞는 다. 다음 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 24 시간 배양한다. 경 피흡수제를 시험할 때는 ｢생균수시험｣의 4.5.1.에 따라 조제한 1 개 패치에 대한 해당량을 멸균멤브레인필터 로 여과하고 이 멤브레인필터를 100 mL의 대두카제인 소화액체배지TMH102TMKH003 중에 넣는다.

4.5.2. 선택배양 만니톨염화나트륨한천배지TMH114에 이식하 고 30 ~ 35 ℃에서 18 ~ 72 시간 배양한다.

4.5.3. 판정 노란색의 띠로 둘러싼 노란색 또는 흰색 집락의 증식은 황색포도상구균의 존재 가능성을 나타 낸다. 이때는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한 다. 위와 같은 종류의 집락이 없거나 동정시험에서 음 성으로 판정될 때 그 제품은 이 시험에 적합하다.

4.6. 클로스트리디아

4.6.1. 검액 조제 및 가열처리 검체 2 g 또는 2 mL 이상을 취하여 ｢생균수시험｣에 따라 10 배 희석액(최 소 20 mL 이상)을 조제한다. 조제한 검액을 최소 10 mL씩 2 개로 나눈다. 그 중 1 개는 80 ℃에서 10 분 간 가열한 다음 빨리 식히고 다른 1 개는 가열하지 않 는다.

4.6.2. 선택배양 각각에서 10 mL 또는 검체 1 g 또는

1 mL에 해당하는 양을 적당량(3.4.에서 결정한)의 강 화클로스트리디아배지TMH115에 접종하여 섞은 다음 혐기적 조건으로 30 ~ 35 ℃에서 48 시간 배양한다. 배양 후 각 용기로부터 콜롬비아한천배지TMH116로 이식하고 혐기적 조건으로 30 ~ 35 ℃에서 48 ~ 72 시간 배양한다.

4.6.3. 판정 카타라제반응음성의 간균(아포가 있거나 또는 없는)의 혐기적 증식은 클로스트리디아의 존재 가능성을 나타낸다. 이때는 양성으로 의심하고 동정시 험으로 확인한다. 위와 같은 종류의 집락이 없거나 동 정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합 하다.

4.7. 칸디다알비칸스

4.7.1. 검체 조제 및 전배양 검체를 ｢생균수시험｣에 따라 조제한다. 그 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL 이상에 해당하는 양을 100 mL의 사부로포도당액체배 지TMH106에 접종하여 섞어 30 ~ 35 ℃에서 3 ~ 5 일간 배양 한다.

4.7.2. 선택배양 사부로포도당한천배지TMH104에 이식하고

30 ~ 35 ℃에서 24 ~ 48 시간 배양한다.

4.7.3. 판정 흰색집락의 증식은 칸디다알비칸스의 존 재 가능성을 나타낸다. 동정시험으로 확인한다. 흰색집 락이 없거나 동정시험에서 음성으로 판정될 때 그 제품 은 이 시험에 적합하다. 아래 항은 정보제공을 목적으로 기재한 것이다.