16 무균시험법

또한 검체, 검체의 조제법, 분산 조건, 셀 종류에 관한 충분한 정보도 기록해 두어야 한다. 측정 결과는 장치, 데이터 분석용 프로그램, 사용한 광학 모델에 따르므로 상세한 내용을 문서로 기록해 두어야 한다. 장치의 성능 관리

장치와 검체에 따라 장치의 성능 평가를 장치 설명서와 기술된 수행절차로 적절한 빈도로 실시한다. 교정 레이저 회절 시스템은 이상적인 입자 특성을 가정 하고 있지만 레이저 광산란의 기본 원리에 근거한다. 따 라서 엄밀한 의미에서의 교정은 필요하지 않다. 그래도 장치가 제대로 작동하고 있는지 확인할 필요가 있다. 이 것은 산업에서 널리 쓰이는 인증표준물질을 이용하여 실시할 수 있다. 이에 의해 검체의 채취와 분산, 측정 영 역으로의 검체 수송, 측정 및 디콘볼루션 처리를 포함하 여 전체 측정 절차를 확인할 수 있다. 또한 전체 절차가 충분히 기술되어 있어야 한다.

인증표준물질로는 입자 크기 분포가 알려진 구형 입자 인 것이 바람직하다. 인증표준물질의 입자 크기는 절대 적인 방법에 따라 질량기준 입자 크기 분포로서 보증되 어야 한다. 또한 가능하다면 합의된 상세한 조작 절차에 따라 이용되어야 한다. 미 이론을 데이터 분석에 사용할 때는 입자 복소굴절률의 실수부와 허수부를 표시해야 한다. 입자 밀도가 모든 입자 크기에 대해 동일하다면 체적 기준 입자 크기 분포는 질량 기준 입자 크기 분포 와 동일하게 나타낸다.

인증표준물질은 적어도 3 회 반복 측정을 통해 얻은 x50의 평균값을 그 보증값과 비교할 때 보증 범위에서의 편차가 3 % 이하이면 레이저 회절 장치는 제대로 작동 하고 있다고 본다. 또한 x10과 x90에 관한 평균값은 보증 범위에서의 편차가 5 %를 넘지 않는 것으로 한다. 또한

10 μm 이하의 입자의 경우 이러한 값을 모두 2배로 할 필요가 있다.

표준물질로서 구형 입자를 사용하는 것이 바람직하지 만 비구형 입자를 사용해도 무방하다. 이러한 입자는 인 증값을 가지거나 합의된 상세한 조작 절차에 따라 레이 저 회절법으로부터 구한 대푯값을 가지는 것이 바람직 하다. 레이저 회절법 이외의 방법으로 얻은 참조값(입자 크기)과 비교할 때 상당한 차이가 있을 수 있다. 이 차 이는 입자 크기 측정법의 측정 원리가 다르면 동일한 비 구형 입자라도 구 상당 지름(sphere-equivalent diameters)이 다른 것에 기인한다.

인증표준물질을 사용하는 것이 바람직하지만 물리적 성 질이 명확하게 규정된 다른 표준물질을 사용해도 된다. 이들 물질은 특정 부류의 물질로서 전형적인 조성과 입 자 크기 분포를 가진 물질로 이루어져 있다. 이들의 입 자 크기 분포는 안정하다는 것이 입증되었다. 측정 결과 는 인증표준물질에 대해 미리 측정한 데이터와 동일한 정밀성과 편차로 일치해야 한다. 시스템의 적합성 평가 장치의 교정뿐만 아니라 장치의 성능 평가를 정기적으로 또는 가능한 한 자주 하여야 한 다. 이 성능 평가는 앞에서 설명한 적절한 표준물질을 써서 실시할 수 있다.

시스템의 적합성 평가는 장치, 전자공학계, 소프트웨 어 및 분석 조작이 일체화된 시스템을 구성하고 있기 때 문에 시스템으로 평가할 필요가 있다. 따라서 검체의 채 취, 분산, 측정 영역으로의 검체 수송, 측정과 디콘볼루 션 단계를 포함하여 조작 절차의 전체를 검증하게 된다. 따라서 전체의 조작 절차를 충분히 기술하는 것이 매우 중요하다.

의약품각조에 따로 규정이 없는 한 레이저 회절 장치 의 결과값은 표준물질의 x50에 대한 보증 범위로부터의 편차가 10 % 이내이면 레이저 회절 장치는 정상적으로 작동하고 있는 것으로 간주한다. 또한 분포 양측의 값 (예를 들어 x10, x90)에 대해서 평가할 때도 이러한 값의 보증 범위로부터의 편차는 15 %를 넘어서는 안 된다. 다만, 10 μm 이하의 입자의 경우는 2배로 한다. 참고 : 장치의 교정에 대해서는 교정 항에서 엄격한 조 건을 정하고 있다.

16. 무균시험법

이 시험법은 무균이 요구되는 원료 또는 제제에 적용한다. 이 시험에 적합하다는 결과는 단지 이 시험조건에서 시험한 검체 중에 오염미생물이 검출되지 않았음을 의미한다. 미생물오염에 대한 예방조치 무균시험은 무균조건에서 시 험한다. 따라서 시험환경은 무균시험을 실시하는데 적합 하여야 한다. 오염을 피하기 위한 예방조치는 이 시험으 로 검출되는 어떠한 미생물에도 영향을 주어서는 안된다. 시험하는 작업영역은 적절한 샘플링과 적절한 관리로 정 기적으로 모니터링 한다. 배지와 배양온도

1) 일반요건 배지는 다음과 같이 조제하거나 배지성능시험에 적합한 경우에는 동등한 시판배지도 쓸 수 있다. 무균시험용으로 적합한 배지는 다음과 같다. 액상티오글리콜산배지TMKH001STM2084는 혐 기성균의 배양을 주목적으로 하지만 호기성균도 검출할 수 있다. 대두카제인소화배지TMH102TMKH003는 진균 및 호기성균의 배양 에 적합하다.

2) 액상티오글리콜산배지TMKH001STM2084

L-시스틴 0.5 g

한천

0.75 g

염화나트륨 2.5 g

포도당 5.0 g

또는 포도당 일수화물 5.5 g

효모엑스 (수용성) 5.0 g

카제인제 펩톤 15.0 g

티오글리콜산나트륨 0.5 g

또는 티오글리콜산 0.3 mL

레사주린용액(1→1000), 쓸 때 조제 1.0 mL

물 1000 mL

(멸균한 다음의 pH 7.1 ± 0.2) L-시스틴, 한천, 염화나트륨, 포도당, 효모엑스 및 카제인 제 펩톤을 물과 혼합하고, 가열하여 녹인 다음 티오글리 콜산나트륨 또는 티오글리콜산을 넣어 녹이고 필요하면 1 mol/L 수산화나트륨시액을 넣어 멸균한 다음의 pH가

7.1 ± 0.2가 되도록 조정한다. 필요하면 용액이 끓지 않 도록 주의하면서 다시 가열하여 더울 때에 적신 여과지를 써서 여과한다. 레사주린용액(1→1000)을 넣어 잘 섞은 다음 배양이 끝났을 때 배지의 연한 빨간색 부분이 위로 부터 1/2 이하로 되는 표면적과 깊이의 비를 가지는 용기 에 필요한 양 씩 나누어 넣고 밸리데이션된 조건에서 멸 균한다. 배지를 보존할 필요가 있을 때에는 미리 멸균된 기밀용기에 넣어서 2 ~ 25 ℃에서 보존한다. 배지의 윗 부분이 1/3 이상 연한 빨간색으로 변한 경우는 연한 빨간 색이 소실할 때까지 배지용기를 수욕 또는 유통증기 중에 서 가열하고 용기 중에 비멸균공기가 침입하지 못하도록 주의하면서 급속하게 냉각시켜 1 회에 한하여 사용할 수 있다. 밸리데이션된 기간이 지난 배지를 사용해서는 안된 다. 액상티오글리콜산배지TMKH001STM2084는 30 ~ 35 ℃에서 배양한다. 멤 브레인필터법을 적용할 수 없는 수은계의 보존제를 함유 하는 제품은 배지성능시험에 적합하면 대두카제인소화배지TMH102TMKH003 대신에 액상티오글리콜산배지TMKH001STM2084를 써서 20 ~ 25 ℃에서 배양할 수 있다. 따로 규정된 경우에는 다음과 같이 조제 한 변형티오글리콜산배지TMKH001STM2084도 쓸 수 있다. 한천과 레사주린 용액(1 → 1000)을 제외하고 액상티오글리콜산배지TMKH001STM2084와 같은 조성으로 만들어, 밸리데이션된 조건에서 멸균한다. 멸균한 다음의 pH가 7.1 ± 0.2가 되도록 조정하고, 사 용직전에 수욕에서 가열한다. 변형티오글리콜산배지TMKH001STM2084는 혐기조건에서 30 ~ 35 ℃로 배양한다.

3) 대두카제인소화배지TMH102TMKH003

카제인제 펩톤 17.0 g

대두제 펩톤

3.0 g

염화나트륨

5.0 g

인산수소이칼륨

2.5 g

포도당

2.3 g

또는 포도당일수화물

2.5 g

물 1000 mL

(멸균한 다음의 pH 7.3 ± 0.2) 모든 성분을 물에 녹이고 약간 가온하여 용액으로 한다. 용액을 실온으로 식히고 필요하면 1 mol/L 수산화나트 륨시액을 넣어 멸균한 다음의 pH가 7.3 ± 0.2가 되도록 조정한다. 필요하면 여과하여 적당한 용기에 필요한 양씩 나누어 넣고 밸리데이션된 조건으로 멸균한다. 바로 쓰지 않을 경우에는 미리 멸균된 기밀용기에 넣어 2 ~ 25 ℃ 에서 보존한다. 밸리데이션된 기간이 지난 배지를 사용해 서는 안 된다. 대두카제인소화배지TMH102TMKH003는 20 ~ 25 ℃에서 배 양한다. 배지의 적합성 배지는 다음의 시험에 적합하다. 이 시험은 검체의 무균 시험 실시 전에 또는 병행하여 시험할 수 있다.

1) 배지의 무균성 배지의 일부를 14 일간 배양할 때 미 생물의 증식이 나타나지 않는다.

2) 호기성균, 혐기성균 및 진균에 대한 배지성능시험 시 판 액체배지 및 분말배지 또는 각 성분으로 조제한 배지 의 각 배치에 대하여 시험한다. 적절한 미생물 균주는 표 1과 같다. 액상티오글리콜산배지TMKH001STM2084에는 다음 미생물을 소량(100 CFU 이하) 접종한다. 각 미생물에 대하여 별도의 배지를 쓴다.

: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 대두카제인소화배지TMH102TMKH003에는 다음 미생물을 소량(100 CFU 이하) 접종한다. 각 미생물에 대하여 별도의 배지를 쓴다.

: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, Candida albicans 세균은 3 일을 넘지 않도록, 진균은 5 일을 넘지 않도록 배 양한다. 접종균의 계대수는 시드로트 배양관리방법(seed lot system)을 채택하여 마스터시드로트(master seed lot) 로부터 5 대를 넘지 않도록 한다. 미생물의 증식이 육안 으로 명백하게 관찰될 때 그 배지는 적합하다.

표 1 배지성능시험 및 측정법의 적합성시험에 적절한 시험용 균주 호기성세균 ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276, KCTC 3881※ Staphylococcus aureus Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134, KCTC 1021※ Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, KCTC 2513※ 혐기성세균 Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 또는 ATCC 11437, NBRC 14293 진균 Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594, KCTC 7965※ ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455, KCTC 6317 또 는 6196※ Aspergillus brasiliensis ※ 생물자원센터(KCTC)에서 검증된 시험용 균주임 측정법의 적합성시험 다음에 서술하는 변경내용 이외에는 「제품의 무균시험｣에 제시한 방법과 똑같은 방법으로 시험한다.

1) 멤브레인필터법 시험할 용기의 내용물을 여과한 다 음, 필터를 세정하는 최종회의 무균희석액에 시험용 균 주 100 CFU 이하를 넣고 여과한다.

2) 직접법 시험할 용기의 내용물을 배지에 넣은 다음 시 험용 균주 100 CFU 이하를 그 배지에 접종한다. 어느 접종방법에서든 배지의 적합성 2) 호기성균, 혐기성균 및 진균에 대한 배지성능시험 항에 제시된 균주를 쓴다. 양성대조군으로서 배지의 적합성 2) 배지성능시험을 한 다. 배지를 함유한 모든 용기는 규정온도에서 최장 5 일 간 배양한다. 배양 후 육안으로 관찰하였을 때, 양성대조 군과 유사한 명확한 증식이 있으면 검체는 이 시험조건 에서 항균활성이 없거나 항균활성이 충분히 제거된 것으 로 본다. 이 측정법은 무균시험으로 적합하며 시험조건을 변경할 필요가 없다. 만일 검체 존재 하에 육안으로 관찰 하였을 때, 양성대조군과 유사한 명확한 증식이 없으면, 검체는 이 시험조건에서 항균활성이 충분히 제거되지 않 은 것이다. 이때는 항균활성을 제거하기 위해 조건을 변 경하고 측정법의 적합성시험을 반복한다. 측정법의 적합성시험은 다음의 경우에 수행한다.

가) 새로운 검체에 대하여 무균시험을 하는 경우

나) 시험조건의 변경이 있는 경우 측정법의 적합성시험은「검체의 무균시험」과 동시에 시 험할 수도 있다. 검체의 무균시험

1) 일반요건 멤브레인필터법 또는 직접법으로 시험한다. 시험에는 적당한 음성대조를 쓴다. 멤브레인필터법은 여과 가능한 제품에 적용한다. 예를 들면 여과 가능한 수성, 알코올성 또는 유성의 제품 및 이 시험 조건에서 항균력이 없는 수성 또는 유성의 용제에 혼화 또는 용해하는 제품에 대해서 적용한다.

2) 멤브레인필터법 멤브레인필터는 미생물의 포집효율이 확립되어 있는 공경 0.45 μm 이하의 것을 쓴다. 예를 들면 셀룰로오스질산염 필터는 수용성, 유성, 저농도의 알코올성 용액에, 셀룰로오스아세테이트 필터는 고농도의 알코올성 용액에 쓴다. 항생물질과 같은 의약품에는 따로 적절한 필터가 필요한 경우도 있다. 다음에 제시한 방법은 지름 50 mm의 멤브레인필터를 사용 한다고 가정한 방법이다. 만약 지름이 다른 필터를 쓰면 희석 및 세정액의 용량은 이에 따라 조정한다. 여과기나 멤브레인필터는 적절한 방법으로 멸균한다. 여과장치는 무균조건에서 검액을 도입하여 여과할 수 있으며, 멤브레 인필터를 무균적으로 취하여 배지에 접종하거나, 여과기 자체에 배지를 넣어서 배양하기에 적합하도록 설계되어 야 한다.

가) 수성액제 1 g/L의 육제 또는 카제인제 펩톤 중성용액(pH

7.1 ± 0.2)과 같은 무균희석액의 소량을 여과기 중의 멤브레인필터 위로 옮기고 여과한다. 예를 들면 항생물 질이 시험대상일 때에는 희석액에 적당한 중화제나 불 활화제를 넣을 수 있다.

필요하면 시험할 용기의 내용물을 측정법의 적합성시 험에서 선택한 무균희석액으로 희석한 다음, 표 2에 제 시된 검체의 양 이상을 1 장 또는 복수의 멤브레인필터 위에 넣어 즉시 여과한다. 검체가 항균활성을 가지고 있을 때에는 측정법의 적합성시험에서 사용한 무균 희 석액의 양으로 멤브레인필터를 3 회 이상 세정한다. 측 정법의 적합성시험에서 항균활성을 충분히 제거되지 않은 것이 증명되어도, 멤브레인필터당 100 mL의 세 정액으로 5 회 이상 초과하여 세정하지 않는다. 여과기 로부터 꺼낸 전체 멤브레인필터를 각 배양액으로 옮기 거나 무균적으로 이등분하여 각각을 2개의 배지에 넣 는다. 또는 배지를 멤브레인필터가 장착된 여과기 안 으로 넣는다. 각 배지의 양은 측정법의 적합성시험에 서 사용한 양과 동일하게 사용한다. 배지를 14 일 이 상 배양한다.

표 2 각 배지 당 최소 검체 채취량 따로 규정이 없는 한 용기의 내용량 각각의 배지에 접종하는 최소량 액제

1 mL 미만

1 mL 이상 40 mL 이하

40 mL 초과 100 mL 이하

100 mL 초과 항생물질의 액제 전체량 반량, 단, 1 mL 이상

20 mL

10 %, 단, 20 mL이상

1 mL 현탁 또는 유화시켜 쓰는 비 수용성 의약품, 크림 또는 연고제

0.2 g 이상 고형제

50 mg 미만

50 mg 이상 0.3 g 미만

0.3 g 이상 5 g 이하

5 g 초과 전체량 반량, 단, 50 mg 이상

0.15 g

0.5 g

나) 수용성 고형제 각 배지에 대하여 표 2에 규정된 양 이상을 쓴다. 첨부한 용제, 주사용수, 생리식염주사액 또는 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤 중성용액과 같은 적당한 용제에 녹이고, 선택한 용제에 적합한 멤브레인 필터를 써서 가) 수성액제 항에 따라 시험한다.

다) 기름 및 유성액제 각 배지에 대하여 표 2에 규정된 양 이상을 쓴다. 점도가 낮은 기름 및 유성액제는 희석 시키지 않고 마른 멤브레인필터로 여과한다. 점조성 기 름은 해당시험조건에서 항균성이 없는 것이 증명된 미 리스틴산이소프로필과 같은 적절한 무균용제로 희석할 수 있다. 기름이 자체 무게로 멤브레인필터에 스며들게 한 다음 서서히 가압 또는 흡인하여 여과한다. 측정법의 적합성시험으로 적절하다고 증명된 농도의 적절한 유 화제(예를 들면 10 g/L 폴리소르베이트 80)를 함유하 는 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤 중성용액과 같은 적 당한 무균용액을 써서 멤브레인필터 당 약 100 mL씩 적어도 3 회 세정한다. 가) 수성액제 항에 기재된 것과 같이 멤브레인필터를 배지에 넣거나 여과기에 배지를 넣어 같은 온도에서 같은 기간 배양한다.

라) 연고제 및 크림 각 배지에 대하여 표 2에 규정한 양 이상을 쓴다. 지방기제의 연고제나 유중수형의 유제는 위에 서술한 바와 같이 미리스틴산이소프로필로 1 % 로 희석한다. 필요하면 40 ℃ 이하로 가온한다. 예외적 으로 44 ℃ 이하까지의 가온이 필요한 것도 있다. 가능 한 신속히 여과한 다음 다) 기름 및 유성액제 항에 따 라 조작한다.

3) 직접법 따로 규정이 없는 한 표 2에 규정된 양의 검체 를 그 용량이 배지용량의 10 %를 넘지 않도록 배지에 직접 접종한다. 검체가 항균활성이 있을 때에는 적당한 중화제로 중화시키거나 충분한 양의 배지로 희석하여 시 험한다. 대용량의 검체를 사용할 필요가 있을 때에는 접 종에 의한 희석영향을 고려하여 고농도의 배지를 쓰는 것이 바람직한 경우도 있다. 적절하다면 고농도 배지를 용기내의 검체에 직접 넣는 것도 가능하다.

가) 유성액제 측정법의 적합성시험에서 적합하다는 것 이 증명된 적당한 유화제를 적절한 농도 (예를 들면

10 g/L 폴리소르베이트 80)로 넣은 배지를 쓴다.

나) 연고제와 크림 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤 중 성용액과 같은 적당한 무균희석액에 선택한 유화제를 넣고 유화하여 무균희석액(1 → 10)으로 희석 한 다음 유 화제를 함유하지 않은 배지에 접종한다. 접종된 배지는 14일 이상 배양한다. 배양기간 중에 배양 상태를 수 회 관찰한다. 유성검체를 함유한 배양물을 매일 조용히 흔 든다. 그러나 혐기성균 검출을 위해 액상티오글리콜산 배지TMKH001STM2084를 쓸 때에는 혐기조건을 유지하기 위해 흔들어 섞 는 것을 최소한으로 한다. 관찰과 결과의 판정 배양기간 중 및 최종일에 배지에서의 미생물의 증식유무를 육안으로 조사한다. 검체가 배지를 혼탁시켜 미생물증식의 유무를 육안으로 쉽게 판정할 수 없을 때에는 배양 시작일로부터 14 일 후에 해당 배지의 일부(1 mL 이상)를 같은 배지의 새로운 용기에 접종하 고, 본래의 배지와 접종시킨 배지를 4 일 이상 배양한다.

미생물의 증식이 관찰되지 않을 때 검체는 무균시험에 적합하다. 미생물의 증식이 관찰될 때에는 해당 검체와 관계없는 원인에 의하여 시험이 무효함을 명확하게 증명 할 수 없는 한 검체는 무균시험에 적합하지 않다. 아래 조건 중 1 개 이상 해당될 경우 이 시험은 무효로 한다.

가) 무균시험시설의 미생물학적 모니터링 데이터에 문 제가 나타난 경우

나) 무균시험 중에 쓴 시험방법을 조사한 결과 문제가 나타난 경우

다) 음성대조 중에 미생물의 증식이 나타난 경우

라) 해당 무균시험으로부터 분리된 미생물을 동정한 다 음 그 균종의 증식이 무균시험 실시 중에 쓴 재료 및 용기 모두, 또는 어느 한 쪽에 문제가 있음이 명 확히 판단되는 경우

시험이 무효인 것이 판명되면 최초 시험과 같은 수의 용 기를 써서 재시험을 행한다. 재시험에서 미생물의 증식이 관찰되지 않을 때 검체는 무균시험에 적합하다. 재시험에 서 미생물의 증식이 관찰될 경우에 검체는 무균시험에 적 합하지 않다. 무균시험 적합이 요구되는 주사제, 안연고제, 점안제 및 다른 비주사제에 대한 시험 적용 멤브레인필터법을 쓸 때에는 가능하면 용기내의 전량을 쓴다. 단, 표 2에 표시 한 양 이상을 쓴다. 필요하면 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤 중성용액과 같은 적당한 무균용액으로 약 100 mL 로 희석한다.

직접법을 쓸 때에는 따로 규정이 없는 한 표 2에 제시한 양을 쓴다. 시험제품의 동일한 검체에 대하여 세균 및 진 균에 대한 무균시험을 한다. 한 개의 용기 중의 내용량이 두 시험을 하는데 불충분한 경우는 두 개의 용기 이상의 내용물을 다른 배지에 접종하는데 쓴다. 시험에 필요한 최소 검체수 시험에 필요한 최소 검체수는 로트 크기에 따라 표 3에 표시한 개수를 쓴다.

표 3 시험에 필요한 최소 검체수 로트당 제조 개수* 따로 규정이 없는 한, 각 배지당 최소 검체수** 주사제

100 개 이하

101 개 이상 500 개 이하

501 개 이상

10 % 또는 4 용기 중 많은 쪽

10 용기

2 % 또는 20 용기 (대용량제제 의 경우는 10 용기) 중 작은 쪽 안연고제 및 점안제 등의 비주사제

200 개 이하

201 개 이상

5 % 또는 2 용기 중 많은 쪽

10 용기 1회용 제품의 경우에 주사제에 준한 개수를 채취한다. 고형 벌크제품

4 용기 이하

5 용기 이상 50 용기 이하

51 용기 이상 각 벌크용기

20 % 또는 4 용기 중 많은 쪽

2 % 또는 10 용기 중 많은 쪽 * 로트 크기를 알 수 없는 경우에 여기에 제시한 최대수를 사 용한다. ** 한 용기의 내용량이 두 배지에 접종하는데 충분한 양이면 여기에 제시한 용기 수로 한다.