ES 05702.2 중온일반세균 · 건조필름법

(Total Colony Counts in 35 ℃-Dry Rehydratable Film Method)

1.0

개요

1.1

목적

이 시험방법은 먹는물, 샘물·먹는샘물, 염지하수·먹는염지하수, 먹는해양심층수, 먹는물공동시설 등에 존재하는 중온일반세균을 분석할 때 검사결과의 정확성과 통일성을 제공하는 데 필요한 제반사항을 규정함을 목적으로 한다.

1.2

적용범위

이 시험방법은 「먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙」 제2조의 규정에 따른 먹는물, 샘물·먹는샘물, 염지하수·먹는염지하수, 먹는해양심층수, 먹는물공동시설 등의 수질 검사에 적용한다.

1.3

“내용 없음”

2.0

용어정의

2.1

중온일반세균

(35.0 ± 0.5) ℃에서 표준한천배지 또는 트립톤 포도당 추출물 한천배지TM466 또는 이와 상 응하는 배지에 집락을 형성하는 모든 세균을 말한다.

3.0

분석기기 및 기구

3.1

피펫 또는 자동피펫

부피 1 mL ～ 5 mL의 메스피펫이나 자동피펫(플라스틱팁 포함)으로 멸균된 것을 사용한다. 3.2

배양기

배양온도를 (35.0 ± 0.5) ℃로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

4.0

시약 및 표준용액

4.1

배지

기본 영양성분과 지시약, 수용성 성분이 얇은 막 형태로 되어있고, 배양 후 일반세균 의 염색이나 대사산물과 반응을 통해 시각적으로 대상이 되는 집락을 구별 및 계수할 수 있어야 한다.

[주 1] 보관 조건, 유효기간 및 사용방법 등은 제조사의 설명서를 따른다.

[주 2] 건조필름배지는 ISO 16140에 따라 기준시험법과 동등성이 검증된 제품이거나, 국제 인증기관의 인증을 받은 제품에 한하여 사용한다.

4.2

희석액(diluent)

4.2.1

인산완충희석액(phosphate buffered diluent)

인산이수소칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09) 34 g을 정제수 500 mL에 녹인 후 0.5 M 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH, 분자량: 40.00) 용액으로 실온에서 pH를 (7.2 ± 0.2)로 조정한 다음 정제수를 넣어 1 L가 되도록 만든 뒤

이를

보존용

원액으로

한다.

염화마그네슘

육수화물(magnesium

chloride, MgCl2·6H2O, 분자량 : 203.30)(0.25 mol/L) 81.1 g을 정제수 1 L에 녹여 염화마그네 슘용액으로 한다. 인산완충희석액은 보존용 원액 1.25 mL와 염화마그네슘용액 5.0 mL 를 넣은 다음 정제수로 최종 1 L가 되도록 만든 후 (99 ± 2) mL 또는 (9.0 ± 0.2) mL 가 되도록 나선식 마개가 있는 희석병이나 시험관에 나누어 121 ℃에서 15분간 고압증 기멸균한다.

펩톤희석액(peptone diluent)

정제수에 10 % 펩톤(peptone) 용액을 넣어 펩톤의 최종농도가 0.1 %가 되도록 희석하고, 실온에서 pH가 (6.8 ± 0.2)가 되도록 조정한 다음 (99 ± 2) mL 또는 (9.0 ± 0.2) mL가 되도록 나선식 마개가 있는 희석병이나 시험관에 나누어 121 ℃에서 15분간 고압증기 멸균한다.

4.2.3

멸균생리식염수

염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44) 8.5 g을 증류수에 녹여 1 L가 되도록 만든 뒤 나선식 마개가 있는 희석병이나 시험관에 나누어 121 ℃에서 15분간 고압 증기멸균한다.

5.0

시료채취 및 관리

5.1

멸균된 시료용기를 사용하여 무균적으로 시료를 채취하고 즉시 시험해야 한다. 즉시 시험할 수 없으면 빛이 차단된 1 ℃ ～ 5 ℃ 냉장 보관 상태에서 24시간 이내에 시험해야 한다.

5.2

잔류염소가 존재하는 경우, 잔류염소 제거를 위한 시약은 잔류염소 4 mg/L 이하인 시료 1 L 기준으로 멸균한 티오황산나트륨 용액 (80 g/L) 1 mL에 준하는 양을 첨가하 며, 잔류염소의 농도에 따라 첨가량을 조절한다.

5.3

수도꼭지에서 시료를 채취할 때는 수도꼭지를 틀어 수돗물을 2분 ～ 3분간 흘려버 린 후 시료를 채취한다. 수도꼭지에 연결된 부착물은 제거하고, 깨끗한 헝겊이나 휴지로 이물질을 닦아낸 후 시료를 채취한다. 필요하면 가스버너 등으로 수도꼭지 입구를 충 분히 소독한다.

5.4

먹는샘물, 먹는해양심층수, 먹는염지하수 제품수는 병의 마개를 열지 않은 상태의 제품을 말하며, 병의 마개가 열린 것은 시료로 사용할 수 없다. 병에 넣은 후 12시간 안 에 4 ℃를 유지한 상태에서 검사한다.

6.0

정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1

이 시험방법을 처음 실시할 경우나 사용하던 제품, 시약 등이 바뀔 때마다 평판집락법을 이용하여 중온일반세균을 분석하는 방법과 동등 또는 이상의 결과값을 확보한 후에 실험을 진행한다.

6.2

분기별 1회 이상은 평판집락법을 이용한 중온일반세균의 분석 결과와 비교하여야 한다.

6.3

음성대조군 시험으로 멸균된 희석액을 상기 방법과 동일하게 실험하여 음성대조군 으로 하며, 음성대조군 시험결과는 음성으로 나왔을 때만 유효한 결과값으로 판정한다. 7.0

분석절차

7.1

시판 제품의 설명서에 따라 적정범위가 되도록 시료를 희석한다. 시험용액 1 mL 씩 2매 이상 중온일반세균 건조필름배지에 접종한다.

[주 3] 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작 의 무균 여부를 확인한다.

7.2

배지가 응고되면 (35 ± 0.5) ℃에서 먹는샘물, 먹는해양심층수, 먹는염지하수, 샘물 과 염지하수는 (24 ± 2)시간, 그 외 수돗물을 포함한 먹는물은 (48 ± 2)시간 배양하여 형 성된 집락수를 계산한다.

7.3

음성대조군 시험으로 멸균된 희석액을 상기 방법과 동일하게 실험하여 음성대조군 으로 하며, 음성대조군 시험결과는 음성으로 나왔을 때만 유효한 결과값으로 판정한다. 7.4

중온일반세균 건조필름배지에서 양성 집락수를 계산하고 그 평균집락 수에 희석배 수를 곱하여 중온일반세균 수를 산출한다.

8.0

결과보고

결과 표기

해당 희석배수에 사용된 각 건조필름배지 내의 집락수를 측정하여 합한 다음 사용한 건조필름배지수로 나누어 건조필름배지당 평균집락수를 구한다. 여기에 해당 희석배수 를 곱한 수치를 중온일반세균수(CFU)로 하며, ‘중온일반세균수(CFU)/mL’로 표기한다. 중온일반세균수가 100 이상일 때는 높은 단위 숫자로부터 3단계 이하는 반올림하여 유효숫자를 2단계로 끊어 그 이하를 0으로 한 수치를 mL 중 중온일반세균수로 하고, 중온일반세균수가 100 미만일 때 소수점을 포함하면 반올림하여 정수로 표기한다. 9.0

참고자료

9.1

Standard Method 9215, 23rd edition, Heterotrophic plate count, (2017)

9.2

KS I ISO 6222, “수질 ― 배양 가능한 미생물 ― 영양한천 배양배지 속 접종에 의 한 집락 계수”, 환경부, (2024)

9.3

식품 공전, “제8 일반시험법 4장 미생물시험법”, 식품의약품안전처, (2022) 9.4

ISO 16140-2, “Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method”, ISO, (2016)

10.0

“내용 없음”