4.7 대장균군

대장균군은 Gram음성, 무아포성 간균으로서 유당을 분해하여 가스를 발생하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성세균을 말한다. 대장균군 시험에는 대장균군의 유무를 검사하는 정성시험과 대장균군의 수를 산출하는 정량시험이 있다.

4.7.1 정성시험

가. 유당배지법

유당배지를 이용한 대장균군의 정성시험은 추정시험, 확정시험, 완전시험의 3단계로 나눈다.

4.3 제조법에 따른 시험용액 10 mL를 2배 농도의 유당배지(배지 2TM757)에, 시험용액 1 mL 및 0.1 mL를 유당배지(배지 2TM757)에 각각 3개 이상씩 가한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL을 각각 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

1) 추정시험

시험용액을 접종한 유당배지(배지 2TM757)를 35～37℃에서 24±2시간 배양한 후 발효관내에 가스가 발생하면 추정시험 양성이다. 24±2시간 내에 가스가 발생하지 아니하였을 때에 배양을 계속하여 48±3시간까지 관찰한다. 이 때까지 가스가 발생하지 않았을 때에는 추정시험 음성 이고 가스발생이 있을 때에는 추정시험 양성이며 다음의 확정시험을 실시한다.

2) 확정시험

추정시험에서 가스 발생한 유당배지발효관으로부터 BGLB 배지(배지 3TM365)에 접종하여 35～ 37℃에서 24±2시간 동안 배양한 후 가스발생 여부를 확인하고 가스가 발생하지 아니하였을 때에는 배양을 계속하여 48±3시간까지 관찰한다. 가스발생을 보인 BGLB 배지(배지 3TM365)로부터 Endo 한천배지(배지 5TM372) 또는 EMB 한천배지(배지 6TM336)에 분리 배양한다. 35～37℃에서 24±2 시간 배양 후 전형적인 집락이 발생되면 확정시험 양성으로 한다. BGLB배지에서 35～37℃로 48±3시간 동안 배양하였을 때 배지의 색이 갈색으로 되었을 때에는 가스생성여부와 관계없이 반드시 완전시험을 실시한다.

3) 완전시험

확정시험의 Endo 한천배지(배지 5TM372)나 EMB한천배지(배지 6TM336)에서 전형적인 집락 1개 또는 비전형적인 집락 2개 이상을 보통한천배지(배지 8TM341) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40TMH103)에 접종하여 35∼37℃에서 24±2시간 동안 배양한다. 보통한천배지 또는 Tryptic Soy 한천배지의 집락에 대하여 그람음성, 무아포성 간균이 증명되면 완전시험은 양성이며 대장균군 양성으로 판정한다.

나. BGLB 배지법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 0.1 mL를 2개씩 BGLB 배지(배지 3TM365)에 가한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 대량의 시험용액을 가할 필요가 있을 때에는 대량의 배지를 넣은 발효관을 사용한다. 시험용액을 넣은 BGLB 배지(배지 3TM365)을 35∼37℃에서 48±3시간 배양한 후 가스 발생을 인정하였을 때에는(배지를 흔들 때 거품 모양의 가스의 존재를 인정하였을 때에도) Endo 한천배지 (배지 5TM372) 또는 EMB 한천배지(배지 6TM336)에 분리 배양한다. 이하의 조작은 가. 유당배지법의 확정시험 또는 완전시험 때와 같이 행하여 대장균군의 유무를 확인한다.

다. 데스옥시콜레이트 유당한천 배지법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 10배 단계 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상 씩에 무균적으로 취하고 약 43～45℃로 유지한 데스옥시콜레이트 유당한천배지(배지 9TM089) 또는 VRBA 평판배지(배지 90TM426) 약 15 mL를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 회전하여 검체와 배지를 잘 혼합한 후 응고 시킨다. 그리고 그 표면에 동일한 배지 또는 보통한천배지를 3～5 mL를 가하여 중첩시킨다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 이것을 35～ 37℃에서 24±2 시간 배양 한 후 전형적인 암적색의 집락을 인정하였을 때에는 1개 이상의 집락을, 의심스러운 집락일 경우에는 2개 이상을 Endo 한천배지(배지 5TM372) 또는 EMB 한천배지 (배지 6TM336) 또는 MacConkey 배지(배지 30TMH110TM1898)에서 분리 배양한다. 이하의 조작은 가. 유당배지법의 확정시험 또는 완전시험 때와 같이 행하고 대장균군의 유무를 시험한다.

4.7.2 정량시험

가. 최확수법

최확수란 이론상 가장 가능한 수치를 말하여 동일 희석배수의 시험용액을 배지에 접종하여 대장균군의 존재 여부를 시험하고 그 결과로부터 확률론적인 대장균군의 수치를 산출하여 이것을 최확수(MPN)로 표시하는 방법이다. 최확수는 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 각각 5개씩(별표 1) 또는 3개씩(별표 2) 발효관에 가하여 배양 후 얻은 결과에 의하여 검체 1 mL중 또는 1 g중에 존재하는 대장균군수를 표시하는 것이다.

예로 검체 또는 희석검체의 각각의 발효관을 5개씩 사용하여 다음과 같은 결과를 얻었다면 최확수표에 의하여 시험검체 1 mL중의 MPN은 70으로 된다. 이 때 접종량이 1, 0.1, 0.01 mL 일 때에는 70/10=7로 한다. 10, 1, 0.1 mL일 때에는 70/100=0.7로 한다.

시험용액 접종량

0.1 mL

0.01 mL

0.001 mL

MPN

가스발생양성관수

5 개

2 개

1 개

70

시험용액 접종이 4단계 이상으로 행하여졌을 때에는 다음 표와 같이 취급한다.

예

가스발생 양성관수

유효숫자

1 mL

0.1 mL 0.01 mL

0.001

mL

1 mL

0.1 mL 0.01 mL

0.001

mL

I

5

5

2

0

-

5

2

0

II

5

4

3

0

5

4

3

-

III

0

1

0

0

0

1

0

-

IV

5

3

1

1

5

3

2

-

예 I, II : 5개 양성을 표시한 최소 접종량부터 시작한다.

예 III : 양성을 인정한 접종량을 중간으로 한다.

예 IV : 최소 유효 접종량 보다 1단계 적은 접종량에서 양성을 인정한 때에는 양성을

인정한 수를 최소유효 접종량의 양성관 수에 더한다(0.001 mL 단계의 양성관의

수를 0.01단계의 양성관의 수에 더함)

1) 유당배지법

4.3 제조법에 따른 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 5개 또는 3개씩의 유당배지(배지 2TM757)에 접종한다. 단, 10 mL를 접종할 때에는 2배 농도 유당 배지를 사용하고 0.1 mL 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1 mL씩 사용한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 가스발생 발효관 각각에 대하여 추정, 확정, 완전시험을 행하고 대장균군의 유무를 확인한 다음 최확수표로부터 검체 1 mL 또는 1 g중의 대장균군수를 구한다. 이때 시험용액을 가한 배지의 전부 또는 대부분에서 가스발생이 인정되거나 또 최소량을 가한 배지의 전부 또는 대부분이 가스가 발생되지 않도록 접종량과 희석도를 고려하여야 한다

2) BGLB배지법

4.3 제조법에 따른 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 5개 또는 3개씩 BGLB 배지(배지 3TM365)에 각각 접종한다. 단, 10 mL를 접종할 때에는 2배 농도 BGLB 배지를 사용하고 0.1 mL 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1 mL씩 사용한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 이때 시험용액을 가한 배지의 전부 또는 대부분에서 가스발생이 인정되거나 또 최소량을 가한 배지의 전부 또는 대부분이 가스가 발생되지 않도록 접종량과 희석도를 고려하여야 한다. 이하의 조작은 각 발효관에 대하여 BGLB 배지에 의한 정성시험에 따라 하고 대장균군의 유무를 확인한 다음 최확수표로부터 검체 1 mL 또는 1 g 중의 대장균군수를 산출한다.

나. 데스옥시콜레이트유당한천배지법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL에 대하여 이 배지에 의한 정성시험과 같은 조작으로 35～37℃에서 24±2시간 배양한 후 생성된 집락중 전형적인 집락 또는 의심스러운 집락에 대하여 정성시험 때와 같은 조작으로 대장균군의 유무를 결정한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 균수 산출은 4.5.1 일반세균수에 따라 한다.

다. 건조필름법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 2매 이상씩 건조필름배지에 접종한 후, 35±1℃에서 24±2시간 배양한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 건조필름배지에서 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출하거나 4.5.1 일반세균수에 따라 한다 (검체에 따라 결과에 의심이 있을 경우 가. 최확수법 혹은 나. 데스옥시콜레이트유당한천 배지법을 사용하여야 한다). 세부적인 배양온도, 배양시간, 집락의 색깔 등은 해당 제조사의 사용지침을 우선하여 따른다.

라. 자동화된 최확수법(Automated MPN)

우유류, 유당분해우유, 가공유(무지유고형분 5.5%미만인 제품 제외), 발효유류, 가공치즈, 조제유류, 분유류, 건조저장육류, 식육추출가공품, 알가열제품 검사에 한한다.