ES 05702.1 중온일반세균 · 평판집락법

(Total Colony Counts in 35 ℃-Pour Plate Method)

1.0

개요

1.1

목적

이 시험방법은 먹는물, 샘물·먹는샘물, 염지하수·먹는염지하수, 먹는해양심층수, 먹는물공동시설 등에 존재하는 중온일반세균을 분석할 때 검사결과의 정확성과 통일성을 제공하는 데 필요한 제반사항을 규정함을 목적으로 한다.

1.2

적용범위

이 시험방법은 「먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙」 제2조의 규정에 따른 먹는물, 샘물·먹는샘물, 염지하수·먹는염지하수, 먹는해양심층수, 먹는물공동시설 등의 수질 검사에 적용한다.

1.3

“내용 없음”

2.0

용어정의

2.1

중온일반세균

(35.0 ± 0.5) ℃에서 표준한천배지 또는 트립톤 포도당 추출물 한천배지TM466에 집락을 형성하는 모든 세균을 말한다.

3.0

분석기기 및 기구

3.1

피펫 또는 자동피펫

부피 1 mL ～ 5 mL의 메스피펫이나 자동피펫(플라스틱팁 포함)으로 멸균된 것을 사용한다. 3.2

페트리접시

지름 약 9 cm, 높이 1.5 cm의 유리제품(65 cm2) 또는 1회용 플라스틱(57 cm2)으로 멸균된 것을 사용한다.

3.3

항온수조

수온을 44 ℃ ～ 46 ℃로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.4

배양기

배양온도를 (35.0 ± 0.5) ℃로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

4.0

시약 및 표준용액

4.1

시약

4.1.1

중온일반세균 배지

상용화된 완성제품을 사용할 수 있으며, 제조하여 사용할 때는 정제수 1 L에 한천을 제 외한 표 1 또는 표 2의 조성대로 넣어 녹인 후 pH가 (7.0 ± 0.2)가 되도록 조정한 다음 한천을 넣어 가열용해하고 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균한다.

조 성 트립톤(tryptone)

5.0 g 효모 추출물(yeast extract)

2.5 g 포도당(dextrose, C6H12O6, 분자량 : 180.16)

1.0 g 한천(agar, (C12H18O9)n)

15.0 g 표 1. 표준한천배지(Plate count agar) 조성

성 분

조 성 소고기 추출물(beef extract)

3.0 g 트립톤(tryptone)

5.0 g 포도당(dextrose, C6H12O6, 분자량 : 180.16)

1.0 g 한천(agar, (C12H18O9)n)

15.0 g 표 2. 트립톤 포도당 추출물 한천배지TM466(Tryptone dextrose extract agar) 조성 4.1.2

희석액(diluent)

4.1.2.1

인산완충희석액(phosphate buffered diluent)

인산이수소칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09) 34 g을 정제수 500 mL에 녹인 후 0.5 M 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH, 분자량: 40.00) 용액으로 실온에서 pH를 (7.2 ± 0.2)로 조정한 다음 정제수를 넣어 1 L가 되도록 만든 뒤

이를

보존용

원액으로

한다.

염화마그네슘

육수화물(magnesium

chloride, MgCl2·6H2O, 분자량 : 203.30)(0.25 mol/L) 81.1 g을 정제수 1 L에 녹여 염화마그네 슘용액으로 한다. 인산완충희석액은 보존용 원액 1.25 mL와 염화마그네슘용액 5.0 mL 를 넣은 다음 정제수로 최종 1 L가 되도록 만든 후 (99 ± 2) mL 또는 (9.0 ± 0.2) mL 가 되도록 나선식 마개가 있는 희석병이나 시험관에 나누어 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균한다.

4.1.2.2

펩톤희석액(peptone diluent)

정제수에 10 % 펩톤(peptone) 용액을 넣어 펩톤의 최종농도가 0.1 %가 되도록 희석하고, 실온에서 pH가 (6.8 ± 0.2)가 되도록 조정한 다음 (99 ± 2) mL 또는 (9.0 ± 0.2) mL가 ES 05702.1f 2025 - 4 -

되도록 나선식 마개가 있는 희석병이나 시험관에 나누어 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균한다.

4.1.2.3

멸균생리식염수

염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44) 8.5 g을 증류수에 녹여 1 L가 되도록 만든 뒤 나선식 마개가 있는 희석병이나 시험관에 나누어 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균한다.

4.2

“내용 없음”

5.0

시료채취 및 관리

5.1

멸균된 시료용기를 사용하여 무균적으로 시료를 채취하고 즉시 시험해야 한다. 즉시 시험할 수 없으면 빛이 차단된 1 ℃ ～ 5 ℃ 냉장 보관 상태에서 24시간 이내에 시험해야 한다.

5.2

잔류염소가 존재하는 경우, 잔류염소 제거를 위한 시약은 잔류염소 4 mg/L 이하인 시료 1 L 기준으로 멸균한 티오황산나트륨 용액 (80 g/L) 1 mL에 준하는 양을 첨가하 며, 잔류염소의 농도에 따라 첨가량을 조절한다.

5.3

수도꼭지에서 시료를 채취할 때는 수도꼭지를 틀어 수돗물을 2 분 ～ 3분간 흘려 버린 후 시료를 채취한다. 수도꼭지에 연결된 부착물은 제거하고, 깨끗한 헝겊이나 휴지 로 이물질을 닦아낸 후 시료를 채취한다. 필요하면 가스버너 등으로 수도꼭지 입구를 충분히 소독한다.

5.4

먹는샘물, 먹는해양심층수, 먹는염지하수 제품수는 병의 마개를 열지 않은 상태의 제품을 말하며, 병의 마개가 열린 것은 시료로 사용할 수 없다. 병에 넣은 후 12시간 안 에 4 ℃를 유지한 상태에서 검사한다.

6.0

“내용 없음”

분석절차

7.1

“내용 없음”

7.2

시험방법

7.2.1

4.1.2에 명시한 희석액을 사용하여 희석하고 각 단계의 희석액을 1 mL씩 멸균된 페트리접시 2매에 접종한다. 생성된 평판의 집락수가 30 개 ～ 300개일 때 유효한 결과 로 계수한다.

7.2.2

미리 멸균해서 44 ℃ ～ 46 ℃로 유지한 중온일반세균 배지 10 mL ～ 12 mL씩 을 각각 시료가 들어 있는 페트리접시에 무균 상태로 나누어 넣고 배지와 시료가 잘 혼 합되도록 좌우로 회전시킨다.

7.2.3

배지가 응고되면 (35 ± 0.5) ℃에서 먹는샘물, 먹는해양심층수, 먹는염지하수, 샘물 과 염지하수는 (24 ± 2)시간, 그 외 수돗물을 포함한 먹는물은 (48 ± 2)시간 배양하여 형성된 집락수를 계산한다.

7.2.4

음성대조군 시험으로 멸균된 희석액을 상기 방법과 동일하게 실험하여 음성대조군으로 하며, 음성대조군 시험결과는 음성으로 나왔을 때만 유효한 결과값으로 판정한다.

7.2.5

시료의 희석 조작부터 평판용 배지를 페트리접시에 나누어 넣을 때까지 조작시간은 20분을 초과하지 않아야 한다.

7.2.6

계수할 때는 확산집락이 없고 평판당 30개 ∼ 300개의 집락을 형성한 평판을 선 택하여 집락을 계수하는 것을 원칙으로 하며, 평판마다 집락이 300개 이상 형성되었을 때는 가장 대표적인 평판을 택하여 밀집평판측정법에 따라 집락수를 계산한다. 계산방법은 안 지름이 9 cm인 유리 페트리접시를 사용한 경우에는 1 cm2 내의 집락수를 13군데에서 계수하여 평균한 집락수에 65를 곱하고, 1회용 플라스틱 페트리접시를 사용한 경우에는 57을 곱한다. 평판마다 30개 이하의 집락이 형성되었을 때는 원액을 접종한 평판의 집락을 계수하여 평균값을 기재한다. 집락이 30개 ～ 300개인 평판이 없고 300개 이상인 평판이 1 개 이상 존재하면 300개에 가장 가까운 평판의 집락을 계수한다.

[주 1] 필요시,

집락계수기(colony

counter)

또는

자동화된

집락계수기(automated colony counter)를 사용할 수 있다.

8.0

결과보고

8.1

결과 표기

해당 희석배수에 사용된 각 평판 내의 집락수를 측정하여 합한 다음 사용한 평판수로 나누어 평판당 평균집락수를 구한다. 여기에 해당 희석배수를 곱한 수치를 중온일반세 균수(CFU)로 하며, ‘중온일반세균수(CFU)/mL’로 표기한다. 중온일반세균수가 100 이 상일 때는 높은 단위 숫자로부터 3단계 이하는 반올림하여 유효숫자를 2단계로 끊어 그 이하를 0으로 한 수치를 mL 중 중온일반세균수로 하고, 중온일반세균수가 100 미만일 때 소수점을 포함하면 반올림하여 정수로 표기한다.

9.0

참고자료

9.1

Standard Method 9215, 23rd edition, Heterotrophic plate count(2017).

9.2

HPA

National

Standard

Method,

W4,

Colony

count

by

the

pour plate method(2004).

9.3

일본 상수시험방법 8.1.1.2, 일반세균-표준한천배지법(2001).

10.0

“내용 없음”