4.20 클로스트리디움 보툴리눔

가. 증균배양

고형 또는 반고형물 검체는 동량의 젤라틴 인산완충액(시액 5TM1192)을 첨가하고 균질화하여 시험 용액으로 하며, 액상 검체는 그대로 사용한다. 1～2 g 또는 1～2 mL의 검체를 2개의 Cooked Meat 배지(배지 33TM366) 15 mL에 접종하여 35∼37℃에서 7일간 혐기배양하고 또 2개의 TPGY 배지(배지 50TM1467)에 같은 방법으로 접종하여 26℃에서 7일간 혐기배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 젤라틴 인산완충액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. (검체를 그대로 사용하는 액상 검체는 검체를 가하지 아니한 동일 Cook Meat 배지와 TPGY배지로 무균여부를 확인) 다만, 접종 전 각 배지는 10～15분간 중탕하여 탈산소한 후 신속히 냉각하여 사용하며, 검체는 배지 아래부분에 천천히 접종하고 교반하지 않는다. 배양 7일후 검경하여 전형적인 클로스트리디움이 관찰되면 다음의 분리배양을 실시하고, 관찰되지 않는 경우에는 추가적으로 10일간 더 배양한다.

나. 분리배양

증균배양액 1～2 mL와 동량의 여과 제균한 알코올을 잘 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후, Liver-Veal 난황한천배지(배지 51TM2150) 또는 혐기성 난황한천배지(배지 52TM1962)에 접종하여 35∼ 37℃에서 48±3시간 혐기적으로 배양한다. 배양 후 융기되거나 평평하며, 표면이 매끈하거나 거친 집락으로, 약간 퍼져 있거나 불규칙한 것을 선택하여 약 10개를 취한다. 경우에 따라서는 집락 주위에 혼탁한 환이 생긴다.

다. 확인시험

분리균에 대하여 Gram 양성의 간균과 균체 말단에 아포가 형성되는 것을 관찰하고, 호기 조건으로 35∼37℃에서 2～3일간 배양하였을 경우 균이 발육되지 않는 것을 확인한다. 0.1%의 glucose를 첨가한 GAM 배지(배지 34)에 접종하여 35～37℃에서 1～4일간 배양하여 운동성이 있는 것을 양성으로 판정하며, 질산염환원능이 없으므로 glucose 0.1%, KNO3 0.3%를 가한 GAM 배지(배지 34)에 접종하여 35～37℃에서 2일간 배양한 후 Nitrite 지시약(시액 6)을 가하였을 경우 색의 변화가 없어야 한다. 우유를 pH 6.8되도록 조정하여, FeSO4 0.05～0.1 g을 첨가한 배지에 균을 접종하여 35∼37℃에서 배양한 후 우유를 분해하는 것을 양성으로 판정 (각 독소 type에 따라 분해능이 다름)한다.