4.18 바실루스 세레우스

4.18.1 정성시험

가. 분리배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가하여 균질화한 시험용액을 MYP한천 배지(배지 46TM2221TM197)에 접종하여 30±1℃, 24시간 배양하거나 PEMBA한천배지(배지 92TM1587)에 접종하여 37±1℃에서 24시간 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 배양 후 MYP한천배지에서는 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락 또는 PEMBA한천배지에서는 혼탁한 환을 갖는 청녹색 집락을 선별한다. 이 때 명확하지 않을 경우 24시간 더 배양하여 관찰한다.

나. 확인시험

각 배지에서 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8TM341) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40TMH103)에 접종하고 30±1℃에서 24시간 배양한다. 배양 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람 양성 간균을 확인하고, 확인된 균은 nitrate 환원능, VP, β-hemolysis, tyrosine 분해능, 혐기 배양시의 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시하며, 추가로 30±1℃, 24시간 그리고 상온, 2∼ 3일 추가 배양하여 곤충독소단백질(Insecticidal crystal protein) 생성 확인시험주)도 실시한다.

주) 이 시험법은 Bacillus cereus와 Bacillus thuringiensis를 구분하는 시험법으로, 보통한천 배지에 30℃, 24시간 그리고 상온, 2∼3일 추가 배양한 후 직접 또는 염색하여 현미경 관찰결과 (×1000배), 곤충독소단백질이 확인되면 Bacillus thuringiensis로 한다.

4.18.2 정량시험

가. 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 희석액을 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 한다. 희석액을 사용하여 10배 단계 희석액을 만든다. MYP 한천평판배지(배지 46TM2221TM197)에 단계별 희석용액 총 접종액이 1 mL가 되도록 3∼5장을 도말하여 30±1℃에서 24±2시간 배양한 후 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락을 계수한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8TM341) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40TMH103)에 접종하고 30±1℃에서 18～24시간 배양한 후 4.18.1 정성시험 나. 확인 시험에 따라 확인시험을 실시한다.

다. 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예로 10-1 희석용액을 0.2 mL씩 5장 도말 배양하여 5장의 집락을 합한 결과 100개의 전형적인 집락이 계수되었고 5개의 집락을 확인한 결과 3개의 집락이 바실루스 세레우스로 확인되었을 경우 100×(3/5)×10= 600으로 계산한다.