ES 05710.2 쉬겔라 · 막여과법

(Shigella-Membrane Filtration Method)

1.0

개요

1.1

목적

이 시험기준은 샘물·먹는샘물, 염지하수·먹는염지하수, 먹는해양심층수 등에 존재하는 쉬겔라를 분석할 때 검사결과의 정확성과 통일성을 제공하는 데 필요한 제반사항 을 규정함을 목적으로 한다.

1.2

적용범위

이 시험기준은 「먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙」 제2조의 규정에 따른 샘물· 먹는샘물, 염지하수·먹는염지하수, 먹는해양심층수 등의 수질검사에 적용한다.

1.3

“내용 없음”

2.0

용어정의

2.1

쉬겔라

장내세균의 하나로 운동성이 없고 아포를 만들지 않으며 세균성 이질과 식중독을 일 으키는 그람 음성 간균이다. 락토오스를 분해하지 않으며, 당분해로 산을 형성하지만 기체는 형성하지 않는 생화학적 특성을 지녔다.

3.0

분석기기 및 기구

2024 - 2 -

3.1

여과막

공경 0.45 μm, 지름 47 mm 크기의 미생물 분석용 여과막으로 막의 한 면에 격자가 그려지고 멸균된 것을 사용한다.

3.2

여과장치

여과막을 끼워서 여과할 수 있게 하는 장치로 무균조작이 가능한 것을 사용한다. 3.3

필터깔때기

10 mL ～ 250 mL의 시료를 담을 수 있는 부피로 미리 무균처리한 것을 사용한다. 3.4

피펫 또는 자동피펫

부피 5 mL ∼ 25 mL인 메스피펫이나 자동피펫(플라스틱피펫팁 포함)으로서 멸균된 것을 사용한다.

3.5

마개 달린 유리시험관 또는 유리용기

약 50 mL 부피의 고압증기멸균이 가능하고 투명한 붕규산 재질로 마개 달린 유리시 험관이나 유리병 또는 이에 상응하는 멸균용기를 사용한다.

3.6

페트리접시

지름 약 9 cm, 높이 1.5 cm의 유리제품(65 cm2) 또는 1회용 플라스틱(57 cm2)으로 멸균된 것을 사용한다.

3.7

접종루프(Inoculation loop)

루프의 안지름이 약 3 mm인 접종루프를 사용한다.

핀셋

끝이 뭉툭하고 넓으며 여과막을 집어 올릴 때 여과막을 물리적으로 손상하지 않는 것 으로 화염멸균이 가능한 것을 사용한다.

3.9

가위

무균조작이 가능한 것을 사용한다.

3.10

배양기

배양온도를 (36.0 ± 1.0) ℃로 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.11

광학현미경

4.0

시약 및 표준용액

4.1

시약

4.1.1

증균 배지(셀레나이트 액체배지TM2333, Selenite broth)

상용화된 완성제품을 사용할 수 있으며, 제조하여 사용할 때는 정제수 1 L에 표 1의 조성대로 넣고 pH를 (7.0 ± 0.2)로 조절한다. 60 ℃ ～ 70 ℃에서 가열용해한 후 멸균된 시험관에 7 mL ∼ 10 mL씩 무균 상태로 넣고 식힌다. 이때 끓여서 녹이지 않게 주의한다. 조제된 배지는 2 ℃ ～ 8 ℃에 보관한다.

성 분

조성 트립톤(tryptone)

5.0 g 락토오스(lactose, C12H22O11, 분자량 : 342.30)

4.0 g 셀레나이트(selenite)

4.0 g 인산일수소나트륨(sodium phosphate, dibasic, Na2HPO4, 분자량 : 141.95)

10.0 g 표 1. 증균 배지(셀레나이트 액체배지TM2333, Selenite broth) 조성

2024 - 4 -

4.1.2

추정시험용 배지(자일로스 라이신 데스옥시콜레이트TMH112 한천 선택배지, XLDTMH112 agar) 상용화된 완성제품 및 동등 이상의 성능을 가진 제품을 사용할 수 있으며, 사용할 경우 각 제조사별 조제법을 따를 수 있다. 제조하여 사용할 때는 정제수 1 L에 표 2 의 조성대로 넣고 완전용해될 때까지 가열하며, 이때 배지를 고압증기멸균해서는 안 된 다. 50 ℃ ～ 55 ℃까지 식힌 후 pH를 (7.6 ± 0.1)로 조절한다. 가열할 때 끓는 상태가 1분 ∼ 2분 이상 지속되지 않도록 한다. 조제된 배지는 2 ℃ ～ 8 ℃에 보관하며 4일 이상 저장하지 않는다.

4.1.3

확인시험용 배지(트립틱 소이 배지TMH103TM2381, Tryptic soy agarTMH103TM2381)

상용화된 완성제품을 사용할 수 있으며, 제조하여 사용할 때는 정제수 1 L에 표 3의 조성대로 넣고 완전히 녹인 후 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균하여 미리 멸균된 페 트리접시에 약 15 mL씩 무균 상태로 분주한 후 굳힌다.

성 분

조 성 효모 추출물(yeast extract)

3.0 g L-라이신(L-lysine, C6H14N2O2, 분자량 : 146.19)

5.0 g 자일로스(xylose, C5H10O5, 분자량 : 150.13)

3.75 g 락토오스(lactose, C12H22O11, 분자량 : 342.30)

7.5 g 수크로오스(sucrose, C12H22O11, 분자량 : 342.30)

7.5 g 데스옥시콜린산나트륨(sodium desoxycholate)

2.5 g 시트르산제이철암모늄(ferric ammonium citrate, FeSO(NH4)SO4, 분자량 : 217.80)

0.8 g 티오황산나트륨(sodium thiosulfate, Na2S2O3, 분자량 : 158.11)

6.8 g 염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.50)

5.0 g 한천(agar, (C12H18O9)n)

15.0 g 페놀레드(phenol-red)

0.08 g 표 2. 추정시험용 배지(자일로스 라이신 데스옥시콜레이트TMH112 한천 선택배지, XLDTMH112 agar) 조성 2024

그람염색시약(gram’s stain solution)

상용화된 키트를 사용할 수 있다.

4.1.4.1

용액 A

크리스탈 바이올렛(crystal violet) 2.0 g + 95 % 에탄올(95 % ethanol) 20 mL

4.1.4.2

용액 B

암모늄 옥살레이트(ammonium oxalate) 0.8 g + 정제수 80 mL

4.1.4.3

착색제(요오드용액)

요오드(iodine) 1.0 g + 요오드화칼륨(KI) 2.0 g + 정제수 300 mL

4.1.4.4

탈색제

에탄올(ethanol) 95 mL + 정제수 5 mL

4.1.4.5

대조염색제

사프라닌 O(safranin O) 0.25 g + 95 % 에탄올(95 % ethanol) 10 mL

4.1.5

세균동정키트 또는 세균동정기

성 분

조 성 카제인 췌장효소 소화물(pancreatic digest of casein)

15.0 g 콩의 파파인소화물(papaic digest of soybean meal)

5.0 g 염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.50)

5.0 g 한천(agar, (C12H18O9)n)

15 g 표 3. 확인시험용 배지(트립틱 소이 배지TMH103TM2381, Tryptic soy agarTMH103TM2381) 조성

2024 - 6 -

장내 그람 음성 간균을 동정하려면 상용화된 세균동정키트 또는 세균동정기를 사용한다. 4.2

“내용 없음”

5.0

시료채취 및 관리

5.1

멸균된 시료용기를 사용하여 무균적으로 시료를 채취하고 즉시 시험해야 한다. 즉시 시험할 수 없으면 빛이 차단된 1 ℃ ～ 5 ℃ 냉장 보관 상태에서 30시간 이내에 시험해야 한다.

5.2

잔류염소가 존재하는 경우, 잔류염소 제거를 위한 시약은 잔류염소 4 mg/L 이하인 시료 1 L 기준으로 멸균한 티오황산나트륨 용액 (80 g/L) 1 mL에 준하는 양을 첨가하 며, 잔류염소의 농도에 따라 첨가량을 조절한다.

5.3

수도꼭지에서 시료를 채취할 때는 수도꼭지를 틀어 수돗물을 2분 ～ 3분간 흘려버 린 후 채취한다. 수도꼭지에 연결된 부착물은 제거하고 깨끗한 헝겊이나 휴지로 이물질 을 닦아낸 후 시료를 채취한다. 필요하면 가스버너 등으로 수도꼭지 입구를 충분히 소독 한다.

5.4

먹는샘물, 먹는해양심층수, 먹는염지하수 제품수는 병의 마개를 열지 않은 상태의 제품을 말하며, 병의 마개가 열린 것은 시료로 사용할 수 없다

6.0

“내용 없음”

7.0

분석절차

7.1

“내용 없음”

7.2

시험방법

7.2.1

추정시험

무균조작이 가능한 막여과장치에 250 mL의 시료를 여과한다.

7.2.1.2

여과막은 무균조작이 가능한 가위로 잘라서 증균배지(셀레나이트 액체배지TM2333)가 7 mL ～ 10 mL 들어 있는 시험관에 넣어 (36.0 ± 1.0) ℃에서 24시간 배양한다. 7.2.1.3

접종루프를 이용해 배양액을 취하여 추정시험용 배지(XLDTMH112 한천배지)에 획선 접종한다. 35 ℃에서 24시간 배양하여 붉은색 집락을 쉬겔라 추정시험의 양성으로 판정한다.

7.2.2

확인시험

7.2.2.1

추정시험에서 양성으로 판정된 집락을 순수 분리하여 확인시험용 배지(트립틱 소이 배지TMH103TM2381)로 옮겨 심는다. 그람염색 후 현미경 관찰로 그람 음성, 간균임을 확인하고 상용화된 세균동정키트 또는 세균동정기로 동정한다. 병원성과 역학에 대한 정보를 얻기 위하여 더 자세한 종과 혈청형의 동정을 혈청학적 시험으로 확인할 수 있다.

7.2.2.2

혈청학적 시험방법은 쉬겔라 O항혈청 응집반응 시험을 한다.

7.2.3

모든 시험은 음성대조군 시험을 동시에 실시하여 음성대조군 시험결과는 음성으 로 나왔을 때만 유효한 결과값으로 판정한다.

8.0

결과보고

8.1

결과 표기

쉬겔라균이 검출되지 않으면 ‘불검출/250 mL’로, 검출되면 ‘검출/250 mL’로 표기한다. 9.0

참고자료

9.1

Standard

Method

E,

23rd

edition,

Detection

of

Pathogenic Bacteria-Shigella(2017).

10.0

“내용 없음”